バイオ基礎技術シリーズ (第2回)

(4) 遺伝子解析用サンプル調製の基本と各種分析手法 (10:30～13:00)

　遺伝子解析では、組織、細胞などからのDNA、RNAサンプル抽出手法の選択と品質評価が重要です。本講座では、サンプル調製手法の基本から解析手法に応じた品質評価についてまとめました。また、一般的な遺伝子解析手法も概説します。

1. 遺伝子解析用サンプル調製に向けた環境づくり
   1. DNA、RNAの性質
   2. 組織、細胞の選択と保存
   3. ヌクレアーゼのコンタミと回避方法
   4. サンプル調製に適した実験室の設定
2. DNAの抽出
   1. DNA抽出の原理と方法
   2. 抽出DNAの評価方法
      • 紫外部吸収
      • 電気泳動
      • チップ電気泳動
   3. 全ゲノム増幅法 (WGA)
3. RNAの抽出
   1. RNA抽出の原理と方法
   2. 抽出RNAの評価方法
      • 紫外部吸収
      • 電気泳動
      • チップ電気泳動
4. PCR法 : 遺伝子解析に向けた特定DNA断片の増幅
   1. PCR法の原理
      • 定性
      • 定量PCR
   2. プライマーデザインとPCR反応条件設定の基本
5. 遺伝子解析の各種分析手法概論
   1. 電気泳動
   2. RT-PCRとリアルタイムPCR (遺伝子解析手法としてPCR)
   3. 変異・多型スクリーニング法
      • RFLP
      • SSCP
      • ASO
   4. DNAシークエンシング法 (サンガー法)
   5. 次世代シークエンサーと遺伝子解析の展望
• 質疑応答

(5) もっと増えるPCR、これから始めるリアルタイムPCR (13:50～16:30)

　分子生物学の基礎技術として利用されているPCR (ポリメラーゼ連鎖反応) は研究開発では身近かつ簡便な技術ですが、意外と期待した増幅が得られないことも多いことがあります。本セミナーでは原理からトラブルシューティングまでを解説し、より安定した増幅が得られるような情報をご提供いたします。またPCRをベースとしたリアルタイムPCRをこれから始める方がスムーズに実験ができるような基礎知識と発現解析などの応用例を紹介します。

1. PCR
   1. PCRの原理 :
      まずは基礎技術の仕組みを知る
   2. PCRの試薬と機器 :
      酵素などの役割と機器の構造
   3. PCR実験フローとチェックポイント :
      プライマーデザインと条件検討
   4. トラブルシューティング :
      より良く増幅させるには
      1. サンプルを泳動してもバンドが出ない
      2. 反応液が蒸発してしまう
      3. 最近増幅が悪くなってきた
      4. 装置を変えると、増幅しなくなった
      5. ブロックの場所によって増え方が違う
         副産物が増えてしまう e.t.c.
2. リアルタイムPCR
   1. リアルタイムPCRの原理 :
      なぜ正確な遺伝子の定量ができるのか
   2. リアルタイムPCRのケミストリー :
      SYBR Greenから蛍光プローブ法まで
   3. 発現解析の実験フロー :
      プライマーデザインと条件検討
   4. 発現解析の最新定量法 :
      ⊿⊿Ct法からVandesompele法へ
   5. リアルタイムPCRの応用例 :
      HRM解析、siRNAノックダウン検定ほか
   6. トラブルシューティング :
      均一性の高い増幅を得るためには
      1. 蛍光増幅曲線が立ち上がらない
      2. 蛍光増幅曲線が早めにプラトーに達してしまう
      3. 増幅効率が悪い
      4. 均一性が悪い
      5. ブランクの蛍光増幅曲線が立ち上がってしまう
      6. 融解曲線で2つ以上のピークが出てしまう
      7. 検量線の相関件数が悪い
      8. 蛍光増幅曲線にスパイクノイズが入る e.t.c.
• 質疑応答